我院与中科院贺林院士合作开展分子遗传技术在出生缺陷产前诊断中的临床应用

出生缺陷(birth defects，BD)，是指患儿在出生时即存在形态、结构、功能、代谢、精神及行为等方面的异常，是导致婴儿和儿童死亡的首位原因，是全世界范围的一大公共卫生问题。全世界每年大约有500万出生缺陷婴儿诞生，85%是在发展中国家，我国是世界上人口出生缺陷率高发国家之一，全国出生缺陷总发生率为5.6%，且呈逐年上升趋势，每年新增出生缺陷数约90万例，其中出生时临床明显可见的出生缺陷约有25万例，严重影响着我国出生人口素质。根据WHO和我国合作发表的《出生缺陷疾病经济负担的评价》，我国每年因新生儿缺陷所造成的直接损失达10亿元人民币，先天愚型的治疗费每年20亿元，先天性心脏病治疗费120亿，而用于抚养残疾儿的医疗费用支出每年超过50亿，出生缺陷给家庭和社会带来巨大的精神和经济压力。主要分为遗传性疾病和先天性疾病，遗传物质改变是引起出生缺陷的主要原因，包括基因突变和染色体畸变，治疗困难，疗效不满意，家庭及社会负担重。我市是人口大市，遗传性疾病发病率在国内处于较高水平，属出生缺陷高发地区，因此将分子遗传技术应用到临床产前诊断，最大限度降低我市出生缺陷的发生，具有重大公共卫生意义。

我院是山东医专非隶属附属医院，三级甲等妇幼保健院，担负着全市妇女儿童医疗、保健、康复、教学、科研和基层保健培训、检查指导等任务，临沂市产前筛查与诊断中心、临沂市新生儿疾病筛查中心、临沂市听力诊断中心设在我院，年门诊量90余万人次，产前筛查5万例，新生儿疾病筛查17万例。我院围产医学专业是山东省医药卫生重点专业，产前诊断中心是经省卫生厅审批的我市唯一的一家产前诊断中心，医院发展政策上扶持，硬件上加大投入。

产前筛查与诊断中心(遗传实验室)，2006年先后通过了省卫生厅产前诊断中心评审、省临检中心临床基因扩增实验室的达标验收，2012年又先后通过了复核;拥有产前诊断资质人员11人，临床基因扩增技术上岗证人员5人。医院即将搬迁新院区，在现有基础上将增加700m2的高标准的产前诊断实验室，将增加ABI 3500基因测序分析仪、基因芯片分析系统、ViiA7高通量荧光定量PCR扩增仪、核酸纯化仪、全自动时间分辨荧光免疫分析系统、全自动扫描染色体核型分析系统等设备。

为进一步加强学科建设，不断提高学科水平，我院与遗传生物学家、中科院院士——上海交通大学贺林院士、复旦大学出生缺陷研究中心马端教授的团队牵手合作，在我院建立“上海佰臻基因组学与人类健康研究院临沂联合实验室”，成立“上海佰臻基因组学与人类健康研究院临沂转化医学研究中心”。结合我院情况，重点在出生缺陷三级预防、儿童先天性疾病、儿童精神疾病、妇科肿瘤、乳腺肿瘤、生殖医学、药物基因组学研究等领域开展合作，将贺院士、马教授先进的科技成果转化应用到我市，使得我们不出家门就能享受到世界上最好的技术服务。并在良好合作基础上筹建院士工作站，促进科技成果及时转化，造福沂蒙百姓。

首批转化应用的项目是：

耳聋基因检测

耳聋是临床上常见的疾病，由遗传性因素引起的约占60%左右。2006年第二次残疾人抽样调查显示，我国听力语言残疾者约有2780万，其中1-7岁听障儿童约有80万。我国每年2000万新生儿中，严重听力障碍发生率为1‰-3‰。新生儿出生听力缺陷给家庭及社会带来了严重的经济和精神负担。

通过新生儿耳聋基因检测，可以早期发现携带耳聋基因的患儿(包括迟发性听力缺陷患儿)，为后期的诊断及治疗提供科学依据，有助于及时采取干预措施预防言语障碍的发生，有效降低聋哑发病率。

中国人群中最常见的耳聋基因有四个，分别介绍如下。

(1)线粒体12S rRNA：线粒体位于细胞质中，有自己独立的遗传基因，其中12SrRNA如果发生突变，携带者则对氨基糖苷类药物敏感，使用正常剂量的氨基糖苷类抗生素如新霉素、卡那霉素、阿米卡星、西索米星、庆大霉素和链霉素等，可以造成听力明显下降甚至完全失聪，即所谓的“一针致聋”。每1000个新生儿中，大约会出现2-3个该基因突变的携带者。12SrRNA突变呈母系遗传，即携带者的突变基因只可能来至母亲。如果知晓自己或孩子12SrRNA是否存在突变，则可明确是否可以使用氨基糖苷类抗生素，从而避免此类药物性耳聋的发生。该检测可用于正常人耳聋基因筛查、孕期母亲及新生儿筛查、氨基糖甙类药物应用前的预防性检查等。

(2)GJB2：间隙连接蛋白β2(GJB2)基因突变是最常见的耳聋病因。GJB2基因的产物参与形成细胞间的间隙连接，使相邻细胞间能够进行小分子与代谢物的交换。GJB2基因突变可导致耳蜗功能障碍，约占中国人遗传性耳聋的30%。GJB2基因突变所致的耳聋为常染色体隐形遗传，也就是说，只有父母双方都有GJB2基因的突变，子女才有可能出现耳聋。由于该基因突变是所有耳聋基因中最常见的，所以应该作为常规耳聋基因筛查的首选基因。

(3)SLC26A4基因：SLC26A4基因突变会导致大前庭水管综合征，在耳聋人群中的突变频率位居第二位，仅次于GJB2基因。SLC26A4基因突变可以导致前庭导水管扩大，也可能合并耳蜗畸形。临床上主要表现为高频听力损失为主的感音神经性耳聋，多为重度或极重度耳聋。

(4)GJB3：间隙连接蛋白β3(GJB3)是连接蛋白家族中的一个成员。GBJ3基因突变不仅可以引起显性或隐性形式遗传的感音神经性耳聋，而且还与皮肤疾病以及外周神经病有关。

遗传代谢病检测

遗传代谢病是有代谢功能缺陷的一类遗传病，多为单基因遗传病。遗传代谢病一部分由基因遗传导致，还有一部分是后天基因突变造成，发病期不仅仅是新生儿，覆盖全年龄阶段。

1. 苯丙酮尿症

苯丙酮尿症(简称PKU)是苯丙氨酸羟化酶相关基因突变所致的常染色体隐性遗传病，男女发病率接近1：1，患者双亲均为表型正常的杂合子。依照孟德尔遗传规律，所生子女中正常儿和纯合子患儿各占25%，杂合子占50%，我国一般人群中杂合子的比例约为1/60-1/30。苯丙氨酸羟化酶相关基因位于第12号染色体长臂(12q22-24)，由13个外显子组成，全长约90Kb。目前世界范围内已报告了数百种突变类型。

PKU的发病是由于苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变导致苯丙氨酸(PA)代谢障碍所致。苯丙氨酸是人体必须的氨基酸之一，经食物摄取后，部分被机体蛋白质合成所利用，其余部分经肝脏苯丙氨酸羟化酶的作用转变为酪氨酸，进一步转化为多巴、肾上腺素、黑色素等重要的生理活性物质。由于该症患者肝脏中苯丙氨酸羟化酶的缺乏，导致苯丙氨酸不能转化为酪氨酸，而蓄积在体内，引起中枢神经系统的损伤，同时导致酪氨酸、多巴、肾上腺素、黑色素等生理活性物质的合成障碍，引起一系列的病理改变。

目前，我国PKU患儿中约80%基因突变已明确，还有约20%的基因突变机制未明。每个PKU家庭存在两个突变基因，因此基因诊断可有三种结果：(1)两个突变基因均能诊断清楚;(2)一个突变基因诊断清楚、另一个突变基因诊断不清;(3)两个突变基因均不能诊断清楚。前两种结果可提供产前诊断，第三种结果在鉴别非经典型PKU的前提下，通过连锁分析可以做间接基因诊断时也可进行产前诊断。

由于PKU是遗传性疾病，进行基因诊断时需要患儿和父母同时留取血样，同时因突变基因的种类繁多，分析复杂，因此基因诊断应提前在再次怀孕前半年到一年的时间进行，这样才能在妊娠时依据基因诊断结果进行有针对性的产前诊断。

2. 先天性肾上腺皮质增生症

先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是由于肾上腺皮质激素生物合成酶系中某种或数种酶基因的异常，导致酶活性下降，使皮质醇等激素水平改变所致的一组疾病。常呈常染色体隐性遗传。临床上以21-羟化酶(CYP21)缺陷症为最常见，占90%以上，其发病率约为1/4500新生儿，其中约75%为失盐型，其次为11β-羟化酶缺陷症，约占5%～8%，其发病率约为1/5000～7000新生儿。其他类型均为罕见。

几乎所有CYP21突变都是CYP21和CYP21P(假基因)之间重组的结果。约20%是缺失突变，约75%是基因转换的结果。32%的失盐型病人一条等位基因上有大片段缺失或转换突变，56%在一条等位基因上有内含子2的点突变引起RNA切接异常。在体外实验中证实这些突变使21-羟化酶活性完全或几乎完全丧失。在单纯男性化型，最常见的突变等位基因(35%)为第172号氨基酸密码子存在替代突变(Ile变为Asn)，只保有正常21-羟化酶2%～11%的活性。非经典型中最常见(39%)的突变是第281号氨基酸的突变(Val变为Leu)。

3. 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症

红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是世界上最多见的红细胞酶病，据统计全球约有近4亿人G6PD缺陷。本病常在疟疾高发区、地中海贫血和异常血蛋白病等流行地区出现，地中海沿岸、东南亚、印度、非洲和美洲黑人的发病率较高。我国分布规律呈“南高北低”的态势，长江流域以南，尤以广东、海南、广西、云南、贵州、四川等地为高发区，发生率为4%-15%，个别地区高达40%

本病是由于调控G6PD的基因突变所致，呈X连锁不完全显性遗传。由于G-6-PD基因的突变，导致红细胞葡萄糖磷酸戊糖旁路代谢异常，当机体受到伯氨喹啉型药物等氧化物侵害时，氧化作用产生的H2O2不能被及时还原成水，过多的H2O2可致血红蛋白和膜蛋白均发生氧化损伤，最终造成红细胞膜的氧化损伤和溶血。溶血过程呈自限性，因新生的红细胞G6PD活性较高，对氧化剂药物有较强的“抵抗性”，当衰老红细胞酶活性过低而被破坏后，新生红细胞即代偿性增加，故不再发生溶血。蚕豆诱发的溶血是蚕豆嘧啶核苷及伴蚕豆嘧啶核苷对红细胞氧化作用的结果。

现已知有400多种G6PD变异，但常见致病者只有少数几种。

遗传性乳腺癌-卵巢癌综合症

乳腺癌和卵巢癌是女性最常见恶性肿瘤。在所有中国妇女的乳腺癌中，大约有10-15% 的患者属于家族性乳腺癌。有乳腺癌和卵巢癌家族史的女性，乳腺癌和卵巢癌的发生率远高于无家族史的女性。这种疾病称为遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征。

该病的致病基因主要有2个，即BRCA1和BRCA2。如果BRCA1基因存在突变，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%～85%和15%～45%。如果BRCA2发生突变，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%～85%和10%～20%。中国女性BRCA1基因的突变率为8-10%左右，远高于散发性乳腺癌1%的突变频率。

通常而言，如果一位女性家族中无卵巢癌患者，那么她一生中发生卵巢癌的几率大约为1.4%。如果有1个一级亲属(母女、姐妹)患病，那么发生卵巢癌的机会增加到5%。如果有2个或以上的一级亲属患病，发生卵巢癌的机会进一步上升到7%。如果确定是BRCA1/2有关的遗传性乳腺癌-卵巢癌家族，则发生卵巢癌的机会骤然增加到40%-50%!

综合国内外的研究成果，以及我们在临床中的实际应用，应该进行遗传性乳腺癌-卵巢癌致病基因BRCA-1和BRCA2检测的人群是：(1)一个家族中有一人患乳腺癌或卵巢癌，其家族中的其他女性女性均应该进行检测;(2)如果一个人曾经患一种非乳腺癌或卵巢癌的恶性肿瘤，也应该进行检测;(3)40岁之后的女性，如果经济条件允许，原则上应该进行检测。

染色体疾病无创检测

染色体疾病主要是指由于染色体数目改变(多于或少于46条)或结构异常引起的疾病。

染色体三体综合征是染色体疾病中发病率最高的一类。当细胞内某染色体的数目不是正常的两条而是三条，也即染色体总数目为47条时就会导致三体综合征。最常见的染色体三体综合征有：21三体综合征(T21)、18三体综合征(T18)和13三体综合征(T13)。

染色体疾病是可遗传的，父母双亲任何一方存在染色体缺陷，都可能通过遗传将相应缺陷传递给子女，子女患有相应染色体疾病的风险便会增大。

同时，染色体疾病的发生也具有随机性，没有家族病史的父母双亲也可能生育存在染色体缺陷的患儿。研究发现，染色体疾病的发病率随孕妇年龄的增高而升高。

无创DNA产前检测技术是一项新型的、针对胎儿染色体非整倍体疾病的产前检测新技术。该技术仅需抽取孕妇静脉血，即可判断胎儿是否患有唐氏综合征(T21)、爱德华氏综合征(T18)、帕陶氏综合征(T13)三大染色体非整倍体疾病。

适合进行染色体无创检测的情况有：

(1) 怀孕12-26孕周的单胎准妈妈。

(2) 高龄(年龄≥35岁)，唐筛结果为高风险或者单项指标值改变，孕期B超宝宝NT值增高或其它解剖结构异常，羊水穿刺细胞培养失败，不适宜进行有创产前诊断的准妈妈们。

(3) 病毒携带者、胎盘前置、胎盘低置、羊水过少、RH血型阴性、流产史、先兆流产、珍贵儿、错过有创产前诊断时间。

(4) 希望排除宝宝21三体、18三体、13三体综合征，自愿选择进行无创产前检测的准妈妈们。

检测原理

(1) 孕妇外周血中的胎儿游离DNA从怀孕4周左右就可以检出。孕8周以一定的比例稳定存在于母体外周血浆中，孕周越大含量越高。

(2) 胎儿游离DNA一核小体形式存在，稳定性好。

(3) 胎儿游离DNA半衰期短，分娩后迅速降解，这种特性使其可以作为无创产前检测的最优检测材料。

(4) 正常胎儿和正常母亲的21号染色体均为2倍体，患有唐氏综合征的胎儿其21号染色体为3倍体。假定母亲外周血中胎儿游离DNA的含量为20%，母体自身游离DNA占80%，为了简便表示，假定共有10份DNA拷贝。对于怀有正常胎儿的孕妇来说，其外周血浆的21号染色体游离DNA就是10份，2份来源于胎儿，8份来源于母亲。对于怀有唐氏综合征胎儿的孕妇来说，可以很容易算出其外周血浆的21号染色体游离DNA有11份，3份来源于胎儿，8份来源于母亲。

(5) 对于胎儿游离DNA的含量为20%的情况而言，怀有唐氏综合征胎儿和正常胎儿的母体外周血浆中21号染色体游离DNA比例就是11：10。同样，对于胎儿游离DNA的含量为5%的情况而言，怀有唐氏综合征胎儿和正常胎儿的母体外周血浆中21号染色体游离DNA比例就是10.25:10。

(6) 可以看到，不需要进行胎儿来源和母体来源游离DNA的分离，怀有唐氏综合征胎儿的孕妇外周血浆中21号染色体游离DNA的总含量有个很小比例的升高。理论上我们通过区分这一微小的差异，便可以实现利用胎儿游离DNA进行的胎儿染色体疾病产前检测。

(7) 深度测序技术可以轻易的同时测定超过15亿条DNA序列，产出300G的原始数据，相当于1个人类基因组的100倍。当利用新一代高通量测序技术来分析母体外周血浆中的游离DNA信息的时候，无创DNA产前检测便可以从理论变成现实。

叶酸基因检测

中国育龄妇女体内叶酸缺乏较普遍，每3个育龄妇女就有一人缺乏叶酸。

叶酸属B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。大量研究证实，叶酸缺乏是导致出生缺陷的主要原因。正常的叶酸除可预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产、胎儿宫内发育迟缓、早产、新生儿低出生体重等疾病的发病率。

研究发现，叶酸利用能力受遗传基因影响。如果与叶酸代谢相关的基因发生变异，它们所产生的酶活性就会下降。这些人即使按照常规剂量(400微克/天)补充叶酸，机体叶酸水平仍然会不足。遗传体质的差异决定了机体对叶酸的吸收和利用能力。因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。

有一种情况是，许多孕妇是在无意中怀孕的，增补叶酸的时间往往滞后至少2-3个月，错过了补充叶酸的关键时期。在发达国家，新婚期即开始了叶酸的增补。因此，想在近期生育的女性，应该尽早进行叶酸代谢的基因检测，然后确定叶酸的补充方法。

男性增补叶酸对优生有着同等重要的意义。叶酸摄入不足，男性机体叶酸水平偏低，主要会导致两方面的不良后果：一是精子密度低、活性下降、勃起功能减弱;二是精液中携带的染色体数量异常(过多或过少，即精子中出现“非整倍体”)，引起唐氏综合症或流产。

综上所述，通过最先进的科学手段检测每对新婚夫妇对叶酸的利用能力，不仅可以实现个性化增补叶酸，还可以增强新婚夫妇增补叶酸的意识和依从性，从而更有效地降低新生儿出生缺陷风险。

叶酸代谢密切相关的基因是有2个，即MTHFR和MTRR。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因变异引起相应的酶活性降低可使同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸减少，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症。

1. MTHFR基因

MTHFR基因位于一号染色体lp36.3，全长19.3kb，mRNA全长7105bp，有12个外显子，编码含657个氨基酸的蛋白。

亚甲基四氢叶酸还原酶催化5,10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基甲硫氨酸。该酶是人体叶酸代谢中的一个十分重要的酶。

rs1801131是MTHFR基因第八个外显子上第1298(1337)核苷酸的一个A/C多态，引起MTHFR基因编码的蛋白质第429个氨基酸由Glu变为Ala。在世界人群中的该多态的频率分布，A占77%，C占23%。中国人群中的分布A占81%，C为19%。

rs1801131位点的多态性是影响该酶的活性的一个重要因素。携带MTHFR 1298C等基因的酶活性为野生型的68%左右，因而阻碍了叶酸代谢，引起一系列疾病发病风险增加。

rs1801133是位于MTHFR基因第五个外显子677位上的一个C/T多态，引起MTHFR基因编码的蛋白质第222个氨基酸由Ala(A)变为Val(V)。在世界人群中的该多态的频率分布，A占78%，T占22%。中国人群中的分布A占67%，C为34%。MTHFR 677位点的多态性是影响该酶活性的一个重要因素，导致酶活性和热稳定性下降。若以个体携带677CC基因型时其MTHFR活性为100%，携带CT基因型的活性则为CC的71%，基因型为TT型的只有34%。

2. MTRR基因

MTRR基因位于5p15.3-p15.2，全长32021 kb，mRNA全长3274bp，共有15个外显子，编码具有726个氨基酸的蛋白质。

甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必须氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶(MTR编码)催化的，而甲硫氨酸合酶因为辅助因子维生素B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。

MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因。主要突变型有122M(A66G)、S175L、其它一些片段插入缺失和点突变。其中A66G是最主要和研究最多的突变。

MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一。而同型半胱氨酸、叶酸代谢与许多疾病(Down综合症-先天愚型、神经管疾病、心血管疾病等)相关，因此MTRR突变被认为是这些疾病的高风险因素。

rs1801394是位于5p15.3-p15.2之间的MTRR基因第2个外显子处的一个A/G多态，引起MTRR基因编码的蛋白第22个氨基酸由Ile变为Met(Ile22Met)。在dbSNP数据库中，世界人群中的该多态的频率分布为，A占57.4%，G占42.6%左右。在中国人群中该多态的频率分布为：A占76%，G占24%左右。

rs1801394位点是MTRR上的主要突变，引起甲基维生素缺乏症，并经常用来研究与脊柱裂、Down综合症、神经管缺陷、白血病等疾病的关系。

3、叶酸利用基因检测

基因